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L'immunoterapia ha portato cambiamenti rivoluzionari nel trattamento dei tumori maligni, ma ci sono ancora alcuni pazienti che non possono trarne beneficio. Pertanto, è urgentemente necessario individuare biomarcatori appropriati nelle applicazioni cliniche per prevedere l'efficacia dell'immunoterapia, al fine di massimizzarne l'efficacia ed evitare inutili tossicità.

Biomarcatori approvati dalla FDA

Espressione di PD-L1. La valutazione dei livelli di espressione di PD-L1 mediante immunoistochimica (IHC) produce il punteggio di proporzione tumorale (TPS), che rappresenta la percentuale di cellule tumorali parzialmente o completamente colorate con membrana, di qualsiasi intensità, nelle cellule tumorali sopravvissute. Negli studi clinici, questo test funge da test diagnostico ausiliario per il trattamento del carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) avanzato con pembrolizumab. Se il TPS del campione è ≥ 1%, viene considerata l'espressione di PD-L1; un TPS ≥ 50% indica un'elevata espressione di PD-L1. Nello studio iniziale di Fase 1 (KEYNOTE-001), il tasso di risposta dei pazienti nel sottogruppo PD-L1 TPS > 50% che utilizzavano pembrolizumab è stato del 45,2%, mentre indipendentemente dal TPS, il tasso di risposta di tutti i pazienti che ricevevano questo trattamento con inibitore dei checkpoint immunitari (ICI) è stato del 19,4%. Il successivo studio di fase 2/3 (KEYNOTE-024) ha assegnato in modo casuale pazienti con PD-L1 TPS>50% a ricevere pembrolizumab e chemioterapia standard, e i risultati hanno mostrato un miglioramento significativo della sopravvivenza globale (OS) nei pazienti sottoposti a trattamento con pembrolizumab.

Tuttavia, l'applicazione di PD-L1 nella previsione delle risposte all'ICI è limitata da diversi fattori. In primo luogo, la soglia ottimale per i diversi tipi di cancro varia. Ad esempio, il Pabolizumab può essere utilizzato quando l'espressione tumorale di PD-L1 nei pazienti con cancro gastrico, cancro esofageo, cancro alla vescica e cancro al polmone è rispettivamente dell'1%, 10% e 50%. In secondo luogo, la valutazione della popolazione cellulare dell'espressione di PD-L1 varia a seconda del tipo di cancro. Ad esempio, per il trattamento del carcinoma squamocellulare della testa e del collo ricorrente o metastatico si può scegliere di utilizzare un altro metodo di test approvato dalla FDA, il Comprehensive Positive Score (CPS). In terzo luogo, non esiste quasi alcuna correlazione tra l'espressione di PD-L1 in vari tumori e la risposta all'ICI, il che indica che il background tumorale può essere un fattore chiave nella previsione dei biomarcatori dell'ICI. Ad esempio, secondo i risultati del test CheckMate-067, il valore predittivo negativo dell'espressione di PD-L1 nel melanoma è solo del 45%. Infine, diversi studi hanno dimostrato che l'espressione di PD-L1 è incoerente tra diverse lesioni tumorali in un singolo paziente, anche all'interno dello stesso tumore. In sintesi, sebbene i primi studi clinici sul NSCLC abbiano stimolato la ricerca sull'espressione di PD-L1 come possibile biomarcatore predittivo, la sua utilità clinica in diversi tipi di cancro rimane poco chiara.

Carico mutazionale tumorale. Il Carico mutazionale tumorale (TMB) è stato utilizzato come indicatore alternativo dell'immunogenicità tumorale. Secondo i risultati dello studio clinico KEYNOTE-158, tra i 10 tipi di tumori solidi avanzati trattati con pembrolizumab, i pazienti con almeno 10 mutazioni per megabase (alto TMB) hanno avuto un tasso di risposta più elevato rispetto a quelli con basso TMB. È importante notare che in questo studio, il TMB è stato un predittore di PFS, ma non è stato in grado di predire la sopravvivenza globale (OS).

La risposta alla terapia immunitaria è principalmente guidata dal riconoscimento di nuovi antigeni da parte delle cellule T. L'immunogenicità associata a un TMB più elevato dipende anche da vari fattori, tra cui il neoantigene tumorale presentato dal tumore; il sistema immunitario riconosce i neoantigeni tumorali; la capacità dell'ospite di avviare risposte antigene-specifiche. Ad esempio, i dati suggeriscono che i tumori con la più alta infiltrazione di alcune cellule immunitarie potrebbero in realtà avere un'amplificazione del clone di cellule T regolatorie inibitorie (Treg). Inoltre, l'intervallo di TMB può differire dal potenziale dei neoantigeni TMB, poiché anche il sito esatto della mutazione gioca un ruolo significativo; le mutazioni che mediano diverse vie di presentazione dell'antigene possono influenzare la presentazione (o la mancata presentazione) di nuovi antigeni al sistema immunitario, indicando che le caratteristiche intrinseche e immunologiche del tumore devono essere coerenti per produrre risposte ICI ottimali.

Attualmente, il TMB viene misurato tramite sequenziamento di nuova generazione (NGS), che può variare tra le diverse istituzioni (internamente) o le piattaforme commerciali utilizzate. L'NGS include il sequenziamento dell'intero esoma (WES), il sequenziamento dell'intero genoma e il sequenziamento mirato, che possono essere ottenuti dal tessuto tumorale e dal DNA tumorale circolante (ctDNA). È importante notare che diversi tipi di tumori presentano un'ampia gamma di TMB, con i tumori immunogenici come il melanoma, il NSCLC e il carcinoma squamocellulare che presentano i livelli di TMB più elevati. Analogamente, i metodi di rilevamento progettati per diversi tipi di tumore presentano diverse definizioni dei valori soglia di TMB. Nello studio del NSCLC, del melanoma, del carcinoma uroteliale e del carcinoma polmonare a piccole cellule, questi metodi di rilevamento utilizzano metodi analitici diversi (come il rilevamento WES o PCR per un numero specifico di geni correlati) e soglie (TMB alto o TMB basso) diversi.

I microsatelliti sono altamente instabili. Il microsatellite altamente instabile (MSI-H), come biomarcatore pan-cancro per la risposta all'ICI, ha prestazioni eccellenti nel predire l'efficacia dell'ICI in vari tumori. L'MSI-H è il risultato di difetti di riparazione dei mismatch (dMMR), che portano a un alto tasso di mutazione, soprattutto nelle regioni microsatellite, con conseguente produzione di un gran numero di nuovi antigeni e, in ultima analisi, innescando una risposta immunitaria clonale. A causa dell'elevato carico mutazionale causato dal dMMR, i tumori MSI-H possono essere considerati un tipo di tumore ad alto carico mutazionale (TMB). Sulla base dei risultati degli studi clinici di KEYNOTE-164 e KEYNOTE-158, la FDA ha approvato pembrolizumab per il trattamento dei tumori MSI-H o dMMR. Questo è uno dei primi farmaci pan-cancro approvati dalla FDA sulla base della biologia del tumore piuttosto che dell'istologia.

Nonostante il successo significativo, ci sono anche aspetti da tenere in considerazione quando si utilizza lo stato MSI. Ad esempio, fino al 50% dei pazienti affetti da cancro del colon-retto con dMMR non risponde al trattamento con ICI, evidenziando l'importanza di altre caratteristiche nel predire la risposta. Altre caratteristiche intrinseche dei tumori che non possono essere valutate dalle attuali piattaforme di rilevamento potrebbero essere fattori contribuenti. Ad esempio, è stato segnalato che i pazienti con mutazioni nei geni che codificano importanti subunità catalitiche della polimerasi delta (POLD) o della polimerasi ε (POLE) nella regione del DNA mancano di fedeltà di replicazione e presentano un fenotipo di "supermutazione" nei loro tumori. Alcuni di questi tumori presentano un'instabilità microsatellite significativamente aumentata (appartenendo quindi a MSI-H), ma non mancano proteine ​​di riparazione dei mismatch (quindi non dMMR).

Inoltre, analogamente al TMB, anche l'MSI-H è influenzato dai nuovi tipi di antigeni generati dall'instabilità dei microsatelliti, dal riconoscimento da parte dell'ospite di nuovi tipi di antigeni e dalla reattività del sistema immunitario dell'ospite. Anche nei tumori di tipo MSI-H, un gran numero di mutazioni a singolo nucleotide è stato identificato come mutazioni passeggeri (mutazioni non driver). Pertanto, affidarsi esclusivamente al numero di microsatelliti identificati nel tumore non è sufficiente; il tipo effettivo di mutazione (identificato attraverso profili di mutazione specifici) può migliorare le prestazioni predittive di questo biomarcatore. Inoltre, solo una piccola percentuale di pazienti oncologici presenta tumori MSI-H, il che indica l'attuale necessità di biomarcatori più ampiamente applicabili. Pertanto, l'identificazione di altri biomarcatori efficaci per predire l'efficacia e guidare la gestione del paziente rimane un'importante area di ricerca.

Ricerca sui biomarcatori basata sull'organizzazione

Dato che il meccanismo d'azione dell'ICI è quello di invertire la soppressione delle cellule immunitarie piuttosto che colpire direttamente i percorsi intrinseci delle cellule tumorali, ulteriori ricerche dovrebbero concentrarsi sull'analisi sistematica dell'ambiente di crescita del tumore e dell'interazione tra cellule tumorali e cellule immunitarie, che potrebbe aiutare a chiarire i fattori che influenzano la risposta all'ICI. Molti gruppi di ricerca hanno studiato le caratteristiche tumorali o immunitarie di specifici tipi di tessuto, come le caratteristiche delle mutazioni geniche tumorali e immunitarie, i deficit nella presentazione dell'antigene tumorale o i centri o aggregati immunitari multicellulari (come le strutture linfoidi terziarie), che possono predire le risposte all'immunoterapia.

I ricercatori hanno utilizzato la tecnica NGS per sequenziare l'esoma e il trascrittoma tumorale e immunitario dei tessuti dei pazienti prima e dopo il trattamento con ICI, e hanno condotto un'analisi di imaging spaziale. Utilizzando più modelli integrati, combinati con tecniche come il sequenziamento di singole cellule e l'imaging spaziale, o modelli multi-omici, la capacità predittiva degli esiti del trattamento con ICI è stata migliorata. Inoltre, un metodo completo per la valutazione dei segnali immunitari tumorali e delle caratteristiche intrinseche del tumore ha dimostrato una maggiore capacità predittiva. Ad esempio, un metodo di sequenziamento batch completo che misuri simultaneamente le caratteristiche tumorali e immunitarie è superiore a una singola variabile analitica. Questi risultati evidenziano la necessità di simulare l'efficacia dell'ICI in modo più completo, includendo l'integrazione dei risultati della valutazione della capacità immunitaria dell'ospite, delle caratteristiche intrinseche del tumore e delle componenti immunitarie del tumore nei singoli pazienti, per prevedere meglio quali pazienti risponderanno all'immunoterapia.

Data la complessità dell'integrazione dei fattori tumorali e dell'ospite nella ricerca sui biomarcatori, nonché la potenziale necessità di un'integrazione longitudinale delle caratteristiche del microambiente immunitario, si è iniziato a esplorare i biomarcatori utilizzando la modellazione computerizzata e l'apprendimento automatico. Attualmente, sono emersi alcuni risultati rivoluzionari della ricerca in questo campo, che indicano il futuro dell'oncologia personalizzata assistita dall'apprendimento automatico.

Le sfide affrontate dai biomarcatori basati sui tessuti

Limitazioni dei metodi analitici. Alcuni biomarcatori significativi hanno un'efficacia significativa in determinati tipi di tumore, ma non necessariamente in altri. Sebbene le caratteristiche genetiche specifiche del tumore abbiano una capacità predittiva più elevata rispetto al TMB e ad altri, non possono essere utilizzate per la diagnosi di tutti i tumori. In uno studio condotto su pazienti con NSCLC, le caratteristiche delle mutazioni genetiche sono risultate più predittive dell'efficacia dell'ICI rispetto a un TMB elevato (≥ 10), ma più della metà dei pazienti non è stata in grado di rilevare le caratteristiche delle mutazioni genetiche.

Eterogeneità tumorale. Il metodo basato sui biomarcatori tissutali campiona solo in un singolo sito tumorale, il che significa che la valutazione di specifiche parti del tumore potrebbe non riflettere accuratamente l'espressione complessiva di tutti i tumori nel paziente. Ad esempio, studi hanno riscontrato eterogeneità nell'espressione di PD-L1 tra e all'interno dei tumori, e problemi simili esistono con altri marcatori tissutali.

A causa della complessità dei sistemi biologici, molti biomarcatori tissutali precedentemente utilizzati potrebbero essere stati eccessivamente semplificati. Inoltre, le cellule nel microambiente tumorale (TME) sono solitamente mobili, quindi le interazioni visualizzate nell'analisi spaziale potrebbero non rappresentare le reali interazioni tra cellule tumorali e cellule immunitarie. Anche se i biomarcatori possono idealmente rappresentare l'intero ambiente tumorale in un momento specifico, questi target possono comunque essere indotti e cambiare dinamicamente nel tempo, il che indica che una singola istantanea in un momento specifico potrebbe non rappresentare adeguatamente i cambiamenti dinamici.

Eterogeneità dei pazienti. Anche se vengono rilevate alterazioni genetiche note correlate alla resistenza agli ICI, alcuni pazienti portatori di biomarcatori di resistenza noti potrebbero comunque trarne beneficio, probabilmente a causa dell'eterogeneità molecolare e/o immunitaria all'interno del tumore e in diverse sedi tumorali. Ad esempio, la carenza di β 2-microglobulina (B2M) può indicare una resistenza ai farmaci nuova o acquisita, ma a causa dell'eterogeneità della carenza di B2M tra individui e all'interno dei tumori, nonché dell'interazione dei meccanismi di sostituzione del riconoscimento immunitario in questi pazienti, la carenza di B2M potrebbe non essere fortemente predittiva della resistenza individuale ai farmaci. Pertanto, nonostante la presenza di carenza di B2M, i pazienti possono comunque trarre beneficio dalla terapia con ICI.

Biomarcatori longitudinali basati sull'organizzazione
L'espressione dei biomarcatori può variare nel tempo e con l'impatto del trattamento. Valutazioni statiche e singole di tumori e immunobiologia possono trascurare questi cambiamenti, così come le variazioni del TME tumorale e dei livelli di risposta immunitaria dell'ospite. Diversi studi hanno dimostrato che l'ottenimento di campioni prima e durante il trattamento può identificare con maggiore accuratezza i cambiamenti correlati al trattamento con ICI. Ciò evidenzia l'importanza della valutazione dinamica dei biomarcatori.

Biomarcatori basati sul sangue
Il vantaggio dell'analisi del sangue risiede nella sua capacità di valutare biologicamente tutte le singole lesioni tumorali, riflettendo letture medie piuttosto che letture di siti specifici, rendendolo particolarmente adatto per valutare i cambiamenti dinamici correlati al trattamento. Numerosi risultati di ricerca hanno dimostrato che l'utilizzo del DNA tumorale circolante (ctDNA) o delle cellule tumorali circolanti (CTC) per valutare la malattia minima residua (MRD) può guidare le decisioni terapeutiche, ma questi test dispongono di informazioni limitate sulla possibilità di prevedere se i pazienti possano beneficiare di immunoterapie come l'ICI. Pertanto, il test del ctDNA deve essere combinato con altri metodi per misurare l'attivazione immunitaria o la capacità immunitaria dell'ospite. A questo proposito, sono stati compiuti progressi nell'immunofenotipizzazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e nell'analisi proteomica delle vescicole extracellulari e del plasma. Ad esempio, i sottotipi di cellule immunitarie periferiche (come le cellule T CD8+), l'elevata espressione di molecole di checkpoint immunitario (come PD1 sulle cellule T CD8+ periferiche) e livelli elevati di varie proteine ​​nel plasma (come CXCL8, CXCL10, IL-6, IL-10, PRAP1 e VEGFA) possono essere tutti efficaci integratori dei co-biomarcatori dinamici del ctDNA. Il vantaggio di questi nuovi metodi è che possono valutare i cambiamenti all'interno del tumore (simili a quelli rilevati dal ctDNA) e possono anche rivelare cambiamenti nel sistema immunitario del paziente.

Radiomica
I fattori predittivi dei dati di immagine possono superare efficacemente i limiti del campionamento e della biopsia dei biomarcatori tissutali e possono osservare l'intero tumore e possibili altre sedi metastatiche in qualsiasi momento. Pertanto, potrebbero diventare una parte importante dei biomarcatori dinamici non invasivi in ​​futuro. La radiomica Delta può calcolare quantitativamente le variazioni di molteplici caratteristiche tumorali (come le dimensioni del tumore) in diversi momenti, come prima e dopo il trattamento con ICI, durante il trattamento e nel follow-up successivo. La radiomica Delta non solo può predire la risposta iniziale o l'assenza di risposta al trattamento precoce, ma anche identificare la resistenza acquisita agli ICI in tempo reale e monitorare eventuali recidive dopo la remissione completa. Il modello di imaging sviluppato attraverso la tecnologia di apprendimento automatico è persino migliore del tradizionale standard RECIST nel prevedere la risposta al trattamento e i possibili eventi avversi. Le ricerche attuali indicano che questi modelli radiomici hanno un'area sotto la curva (AUC) fino a 0,8-0,92 nel predire la risposta alla terapia immunitaria.

Un altro vantaggio della radiomica è la sua capacità di identificare con precisione la pseudoprogressione. Il modello radiomico costruito attraverso l'apprendimento automatico è in grado di distinguere efficacemente tra progressione vera e falsa, rimisurando i dati TC o PET per ciascun tumore, inclusi fattori come forma, intensità e consistenza, con un'AUC di 0,79. Questi modelli radiomici potrebbero essere utilizzati in futuro per evitare l'interruzione prematura del trattamento a causa di un'errata valutazione della progressione della malattia.

microbiota intestinale
Si prevede che i biomarcatori del microbiota intestinale predicano la risposta terapeutica all'ICI. Numerosi studi hanno dimostrato che uno specifico microbiota intestinale è strettamente correlato alla risposta di vari tipi di cancro al trattamento con ICI. Ad esempio, nei pazienti con melanoma e tumore al fegato, l'abbondanza di batteri Ruminococcaceae è associata alla risposta all'immunoterapia PD-1. L'arricchimento di Akkermansia muciniphila è comune nei pazienti con tumore al fegato, tumore al polmone o carcinoma a cellule renali, che rispondono bene al trattamento con ICI.

Inoltre, il nuovo modello di apprendimento automatico può essere indipendente dal tipo di tumore e associare specifici generi batterici intestinali alla risposta terapeutica dell'immunoterapia. Altri studi hanno inoltre rivelato il ruolo specifico che i singoli gruppi batterici svolgono nella regolazione del sistema immunitario dell'ospite, esplorando ulteriormente come prevenire o promuovere l'evasione immunitaria delle cellule tumorali.

Terapia neoadiuvante
La valutazione dinamica della biologia tumorale può guidare le successive strategie di trattamento clinico. Lo studio sulla terapia neoadiuvante può valutare l'effetto terapeutico attraverso la remissione patologica nei campioni chirurgici. Nel trattamento del melanoma, la risposta patologica primaria (MPR) è associata al tasso di sopravvivenza libera da recidiva. Nello studio PRADO, i ricercatori determinano le successive misure di intervento clinico, come la chirurgia e/o la terapia adiuvante, sulla base dei dati di remissione patologica specifici del paziente.

Tra i vari tipi di cancro, diverse nuove opzioni di terapia adiuvante non sono ancora confrontabili. Pertanto, la scelta tra immunoterapia in monoterapia o terapia di combinazione è spesso decisa congiuntamente dal medico curante e dal paziente. Attualmente, i ricercatori hanno sviluppato una caratteristica dell'interferone gamma (IFN gamma) contenente 10 geni come biomarcatore per predire la remissione patologica nel melanoma dopo terapia neoadiuvante. Hanno ulteriormente integrato queste caratteristiche in un algoritmo per selezionare i pazienti con risposte forti o deboli alla terapia neoadiuvante. In uno studio di follow-up chiamato DONIMI, i ricercatori hanno utilizzato questo punteggio, combinato con analisi più complesse, non solo per predire la risposta al trattamento, ma anche per determinare quali pazienti con melanoma in stadio III necessitino dell'aggiunta di inibitori dell'istone deacetilasi (HDACi) per migliorare la risposta al trattamento neoadiuvante con ICI.

Modello tumorale derivato dai pazienti
I modelli tumorali in vitro hanno il potenziale per predire le risposte specifiche del paziente. A differenza della piattaforma in vitro utilizzata per l'analisi dello spettro di risposta ai farmaci delle neoplasie ematologiche, i tumori solidi affrontano sfide maggiori a causa della loro microstruttura tumorale unica e delle interazioni con il sistema immunitario. Le semplici colture di cellule tumorali non possono replicare facilmente queste caratteristiche complesse. In questo caso, organi simili a tumori o frammenti di organi provenienti da pazienti possono compensare queste limitazioni strutturali, poiché possono preservare la struttura originale delle cellule tumorali e simulare le interazioni con le cellule immunitarie linfoidi e mieloidi per valutare le risposte ICI in modo specifico per il paziente, riproducendo così con maggiore accuratezza le caratteristiche biologiche in un ambiente tridimensionale più realistico.

Diversi studi innovativi in ​​Cina e negli Stati Uniti hanno adottato questo nuovo modello tumorale tridimensionale in vitro ad alta fedeltà. I ​​risultati dimostrano che questi modelli possono predire efficacemente la risposta del cancro al polmone, del cancro al colon, del cancro al seno, del melanoma e di altri tumori all'ICI. Ciò pone le basi per un'ulteriore verifica e standardizzazione delle prestazioni predittive di questi modelli.