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Nell'ultimo decennio, la tecnologia di sequenziamento genetico è stata ampiamente utilizzata nella ricerca sul cancro e nella pratica clinica, diventando uno strumento importante per rivelare le caratteristiche molecolari del cancro. I progressi nella diagnosi molecolare e nella terapia mirata hanno promosso lo sviluppo di concetti di terapia di precisione tumorale e hanno portato grandi cambiamenti nell'intero campo della diagnosi e del trattamento dei tumori. I test genetici possono essere utilizzati per predire il rischio di cancro, guidare le decisioni terapeutiche e valutare la prognosi, e rappresentano uno strumento importante per migliorare i risultati clinici dei pazienti. Qui riassumiamo i recenti articoli pubblicati su CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol e altre riviste per esaminare l'applicazione dei test genetici nella diagnosi e nel trattamento dei tumori.

Mutazioni somatiche e mutazioni germinali. In generale, il cancro è causato da mutazioni del DNA che possono essere ereditate dai genitori (mutazioni germinali) o acquisite con l'età (mutazioni somatiche). Le mutazioni germinali sono presenti dalla nascita e il mutante solitamente porta la mutazione nel DNA di ogni cellula del corpo e può essere trasmessa alla prole. Le mutazioni somatiche vengono acquisite dagli individui in cellule non gametiche e di solito non vengono trasmesse alla prole. Sia le mutazioni germinali che quelle somatiche possono distruggere la normale attività funzionale delle cellule e portare alla trasformazione maligna delle cellule. Le mutazioni somatiche sono un fattore chiave della malignità e il biomarcatore più predittivo in oncologia; tuttavia, circa il 10-20% dei pazienti affetti da tumore è portatore di mutazioni germinali che aumentano significativamente il rischio di cancro e alcune di queste mutazioni sono anche terapeutiche.
Mutazione driver e mutazione passenger. Non tutte le varianti del DNA influenzano la funzione cellulare; in media, occorrono da cinque a dieci eventi genomici, noti come "mutazioni driver", per innescare la normale degenerazione cellulare. Le mutazioni driver si verificano spesso in geni strettamente correlati alle attività vitali delle cellule, come i geni coinvolti nella regolazione della crescita cellulare, nella riparazione del DNA, nel controllo del ciclo cellulare e in altri processi vitali, e hanno il potenziale per essere utilizzate come bersagli terapeutici. Tuttavia, il numero totale di mutazioni in qualsiasi tumore è piuttosto elevato, variando da poche migliaia in alcuni tumori al seno a oltre 100.000 in alcuni tumori del colon-retto e dell'endometrio altamente variabili. La maggior parte delle mutazioni ha un significato biologico nullo o limitato, anche se la mutazione si verifica nella regione codificante; tali eventi mutazionali insignificanti sono chiamati "mutazioni passenger". Se una variante genetica in un particolare tipo di tumore ne predice la risposta o la resistenza al trattamento, la variante è considerata clinicamente operabile.
Oncogeni e geni oncosoppressori. I geni che subiscono frequentemente mutazioni nel cancro possono essere suddivisi in due categorie: oncogeni e geni oncosoppressori. Nelle cellule normali, la proteina codificata dagli oncogeni svolge principalmente il ruolo di promuovere la proliferazione cellulare e inibire l'apoptosi cellulare, mentre la proteina codificata dai geni oncosoppressori è principalmente responsabile della regolazione negativa della divisione cellulare per mantenere la normale funzione cellulare. Nel processo di trasformazione maligna, la mutazione genomica porta all'aumento dell'attività dell'oncogene e alla diminuzione o perdita dell'attività del gene oncosoppressore.
Piccola variazione e variazione strutturale. Questi sono i due principali tipi di mutazioni nel genoma. Le piccole varianti alterano il DNA modificando, eliminando o aggiungendo un piccolo numero di basi, tra cui mutazioni con inserzione di basi, delezione, frameshift, perdita del codone di inizio, perdita del codone di stop, ecc. La variazione strutturale è un ampio riarrangiamento del genoma, che coinvolge segmenti genici di dimensioni variabili da poche migliaia di basi alla maggior parte del cromosoma, e include variazioni del numero di copie geniche, delezione, duplicazione, inversione o traslocazione cromosomica. Queste mutazioni possono causare una riduzione o un potenziamento della funzione proteica. Oltre alle modifiche a livello dei singoli geni, le firme genomiche fanno anche parte dei report di sequenziamento clinico. Le firme genomiche possono essere viste come modelli complessi di piccole variazioni e/o variazioni strutturali, tra cui il carico mutazionale tumorale (TMB), l'instabilità dei microsatelliti (MSI) e i difetti di ricombinazione omologa.

Mutazione clonale e mutazione subclonale. Le mutazioni clonali sono presenti in tutte le cellule tumorali, sono presenti alla diagnosi e permangono anche dopo l'avanzamento del trattamento. Pertanto, le mutazioni clonali hanno il potenziale per essere utilizzate come bersagli terapeutici tumorali. Le mutazioni subclonali sono presenti solo in un sottoinsieme di cellule tumorali e possono essere rilevate all'inizio della diagnosi, ma scompaiono con la successiva recidiva o compaiono solo dopo il trattamento. L'eterogeneità del cancro si riferisce alla presenza di molteplici mutazioni subclonali in un singolo tumore. In particolare, la stragrande maggioranza delle mutazioni driver clinicamente significative in tutte le specie tumorali comuni sono mutazioni clonali e rimangono stabili durante la progressione del cancro. La resistenza, che è spesso mediata dai subcloni, potrebbe non essere rilevata al momento della diagnosi, ma si manifesta quando il tumore recidiva dopo il trattamento.

La tecnica tradizionale FISH o cariotipo cellulare viene utilizzata per rilevare alterazioni a livello cromosomico. La FISH può essere utilizzata per rilevare fusioni, delezioni e amplificazioni geniche ed è considerata il "gold standard" per l'individuazione di tali varianti, con elevata accuratezza e sensibilità ma con una produttività limitata. In alcune neoplasie ematologiche, in particolare la leucemia acuta, il cariotipo è ancora utilizzato per orientare la diagnosi e la prognosi, ma questa tecnica sta gradualmente venendo sostituita da test molecolari mirati come FISH, WGS e NGS.
Le alterazioni nei singoli geni possono essere rilevate tramite PCR, sia in tempo reale che in drop-PCR digitale. Queste tecniche hanno un'elevata sensibilità, sono particolarmente adatte per l'individuazione e il monitoraggio di piccole lesioni residue e consentono di ottenere risultati in tempi relativamente brevi. Lo svantaggio è che l'intervallo di rilevamento è limitato (solitamente rilevano solo mutazioni in uno o pochi geni) e la possibilità di eseguire test multipli è limitata.
L'immunoistochimica (IHC) è uno strumento di monitoraggio proteico comunemente utilizzato per rilevare l'espressione di biomarcatori come ERBB2 (HER2) e i recettori degli estrogeni. L'IHC può essere utilizzata anche per rilevare specifiche proteine ​​mutate (come BRAF V600E) e specifiche fusioni geniche (come le fusioni ALK). Il vantaggio dell'IHC è che può essere facilmente integrata nel processo di analisi tissutale di routine, quindi può essere combinata con altri test. Inoltre, l'IHC può fornire informazioni sulla localizzazione subcellulare delle proteine. Gli svantaggi sono la scalabilità limitata e gli elevati requisiti organizzativi.
Sequenziamento di seconda generazione (NGS) Il sequenziamento di seconda generazione (NGS) utilizza tecniche di sequenziamento parallelo ad alto rendimento per rilevare variazioni a livello di DNA e/o RNA. Questa tecnica può essere utilizzata per sequenziare sia l'intero genoma (WGS) sia le regioni geniche di interesse. Il WGS fornisce le informazioni più complete sulle mutazioni genomiche, ma presenta numerosi ostacoli alla sua applicazione clinica, tra cui la necessità di campioni di tessuto tumorale fresco (il WGS non è ancora adatto all'analisi di campioni immobilizzati in formalina) e il costo elevato.
Il sequenziamento NGS mirato include il sequenziamento dell'intero esone e il pannello di geni bersaglio. Questi test arricchiscono le regioni di interesse con sonde di DNA o amplificazione tramite PCR, limitando così la quantità di sequenziamento richiesta (l'intero esone costituisce l'1-2% del genoma e persino pannelli di grandi dimensioni contenenti 500 geni costituiscono solo lo 0,1% del genoma). Sebbene il sequenziamento dell'intero esone abbia buone prestazioni nei tessuti fissati in formalina, il suo costo rimane elevato. Le combinazioni di geni bersaglio sono relativamente economiche e consentono flessibilità nella selezione dei geni da testare. Inoltre, il DNA libero circolante (cfDNA) sta emergendo come una nuova opzione per l'analisi genomica dei pazienti oncologici, nota come biopsia liquida. Sia le cellule tumorali che quelle normali possono rilasciare DNA nel flusso sanguigno e il DNA rilasciato dalle cellule tumorali è chiamato DNA tumorale circolante (ctDNA), che può essere analizzato per rilevare potenziali mutazioni nelle cellule tumorali.
La scelta del test dipende dallo specifico problema clinico da affrontare. La maggior parte dei biomarcatori associati alle terapie approvate può essere rilevata mediante tecniche FISH, IHC e PCR. Questi metodi sono ragionevoli per il rilevamento di piccole quantità di biomarcatori, ma non migliorano l'efficienza del rilevamento con l'aumentare della produttività e, se vengono rilevati troppi biomarcatori, potrebbe non esserci abbastanza tessuto per il rilevamento. In alcuni tumori specifici, come il cancro al polmone, in cui i campioni di tessuto sono difficili da ottenere e ci sono più biomarcatori da testare, l'utilizzo della NGS è una scelta migliore. In conclusione, la scelta del test dipende dal numero di biomarcatori da testare per ciascun paziente e dal numero di pazienti da testare per il biomarcatore. In alcuni casi, l'uso di IHC/FISH è sufficiente, soprattutto quando il bersaglio è stato identificato, come nel caso del rilevamento dei recettori degli estrogeni, dei recettori del progesterone e di ERBB2 nelle pazienti con cancro al seno. Se è necessaria un'esplorazione più completa delle mutazioni genomiche e la ricerca di potenziali bersagli terapeutici, l'NGS è più organizzata ed economicamente vantaggiosa. Inoltre, l'NGS può essere presa in considerazione nei casi in cui i risultati dell'IHC/FISH siano ambigui o inconcludenti.

Diverse linee guida forniscono indicazioni su quali pazienti dovrebbero essere idonei per i test genetici. Nel 2020, il gruppo di lavoro ESMO Precision Medicine ha pubblicato le prime raccomandazioni sui test NGS per i pazienti con cancro avanzato, raccomandando l'esecuzione di routine dei test NGS per i campioni tumorali di carcinoma polmonare non a piccole cellule non squamoso avanzato, carcinoma prostatico, carcinoma colorettale, carcinoma delle vie biliari e carcinoma ovarico. Nel 2024, ESMO ha aggiornato le linee guida su questa base, raccomandando l'inclusione del carcinoma mammario e dei tumori rari, come tumori stromali gastrointestinali, sarcomi, tumori della tiroide e tumori di origine sconosciuta.
Nel 2022, il parere clinico dell'ASCO sui test del genoma somatico nei pazienti con tumore metastatico o avanzato afferma che, se una terapia correlata a un biomarcatore viene approvata in pazienti con tumori solidi metastatici o avanzati, il test genetico è raccomandato per questi pazienti. Ad esempio, il test genomico dovrebbe essere eseguito nei pazienti con melanoma metastatico per lo screening delle mutazioni BRAF V600E, poiché gli inibitori di RAF e MEK sono approvati per questa indicazione. Inoltre, il test genetico dovrebbe essere eseguito anche in presenza di un chiaro marcatore di resistenza al farmaco da somministrare al paziente. L'EGFRMAB, ad esempio, è inefficace nel tumore del colon-retto con mutazione KRAS. Quando si valuta l'idoneità di un paziente al sequenziamento genico, è necessario integrare lo stato fisico, le comorbilità e lo stadio del tumore, poiché la serie di passaggi necessari per il sequenziamento del genoma, tra cui il consenso del paziente, l'elaborazione in laboratorio e l'analisi dei risultati del sequenziamento, richiedono che il paziente abbia una capacità fisica e un'aspettativa di vita adeguate.
Oltre alle mutazioni somatiche, alcuni tumori dovrebbero essere testati anche per i geni della linea germinale. Il test per le mutazioni della linea germinale può influenzare le decisioni terapeutiche per tumori come le mutazioni BRCA1 e BRCA2 nei tumori al seno, alle ovaie, alla prostata e al pancreas. Le mutazioni della linea germinale possono anche avere implicazioni per il futuro screening e la prevenzione del cancro nei pazienti. I pazienti potenzialmente idonei al test per le mutazioni della linea germinale devono soddisfare determinate condizioni, che includono fattori come la storia familiare di cancro, l'età alla diagnosi e il tipo di cancro. Tuttavia, molti pazienti (fino al 50%) portatori di mutazioni patogene nella linea germinale non soddisfano i criteri tradizionali per il test delle mutazioni della linea germinale basati sulla storia familiare. Pertanto, per massimizzare l'identificazione dei portatori di mutazioni, il National Comprehensive Cancer Network (NCCN) raccomanda che tutti o la maggior parte dei pazienti con tumore al seno, alle ovaie, all'endometrio, al pancreas, al colon-retto o alla prostata vengano testati per le mutazioni della linea germinale.
Per quanto riguarda la tempistica dei test genetici, poiché la stragrande maggioranza delle mutazioni driver clinicamente significative è clonale e relativamente stabile nel corso della progressione del cancro, è ragionevole eseguire i test genetici sui pazienti al momento della diagnosi di cancro avanzato. Per i test genetici successivi, soprattutto dopo terapia molecolare mirata, il test del ctDNA è più vantaggioso rispetto al DNA del tessuto tumorale, poiché il DNA del sangue può contenere DNA proveniente da tutte le lesioni tumorali, il che è più utile per ottenere informazioni sull'eterogeneità del tumore.
L'analisi del ctDNA dopo il trattamento può essere in grado di predire la risposta del tumore al trattamento e identificare la progressione della malattia prima rispetto ai metodi di imaging standard. Tuttavia, non sono stati stabiliti protocolli per l'utilizzo di questi dati per guidare le decisioni terapeutiche e l'analisi del ctDNA non è raccomandata se non nell'ambito di studi clinici. Il ctDNA può anche essere utilizzato per valutare piccole lesioni residue dopo un intervento chirurgico radicale del tumore. Il test del ctDNA dopo l'intervento chirurgico è un forte predittore della successiva progressione della malattia e può aiutare a determinare se un paziente trarrà beneficio dalla chemioterapia adiuvante, ma non è ancora raccomandato l'utilizzo del ctDNA al di fuori degli studi clinici per guidare le decisioni sulla chemioterapia adiuvante.

Elaborazione dei dati Il primo passo nel sequenziamento del genoma è l'estrazione del DNA dai campioni dei pazienti, la preparazione delle librerie e la generazione di dati di sequenziamento grezzi. I dati grezzi richiedono un'ulteriore elaborazione, tra cui il filtraggio dei dati di bassa qualità, il loro confronto con il genoma di riferimento, l'identificazione di diversi tipi di mutazioni attraverso diversi algoritmi analitici, la determinazione dell'effetto di queste mutazioni sulla traduzione proteica e il filtraggio delle mutazioni della linea germinale.
L'annotazione del gene driver è progettata per distinguere le mutazioni driver da quelle passenger. Le mutazioni driver portano alla perdita o al potenziamento dell'attività del gene oncosoppressore. Piccole varianti che portano all'inattivazione dei geni oncosoppressori includono mutazioni nonsenso, mutazioni frameshift e mutazioni chiave del sito di splicing, nonché la delezione del codone di inizio, la delezione del codone di stop meno frequenti e un'ampia gamma di mutazioni con inserzione/delezione dell'introne. Inoltre, mutazioni missense e piccole mutazioni con inserzione/delezione dell'introne possono anche portare alla perdita dell'attività del gene oncosoppressore quando interessano importanti domini funzionali. Le varianti strutturali che portano alla perdita dell'attività del gene oncosoppressore includono la delezione parziale o completa del gene e altre varianti genomiche che portano alla distruzione del frame di lettura del gene. Piccole varianti che portano a un potenziamento della funzione degli oncogeni includono mutazioni missense e occasionali inserzioni/delezioni dell'introne che prendono di mira importanti domini funzionali proteici. In rari casi, il troncamento delle proteine ​​o le mutazioni del sito di splicing possono portare all'attivazione degli oncogeni. Le variazioni strutturali che portano all'attivazione dell'oncogene includono la fusione genica, la delezione genica e la duplicazione genica.
L'interpretazione clinica della variazione genomica valuta il significato clinico delle mutazioni identificate, ovvero il loro potenziale valore diagnostico, prognostico o terapeutico. Esistono diversi sistemi di classificazione basati sull'evidenza che possono essere utilizzati per guidare l'interpretazione clinica della variazione genomica.
Il Precision Medicine Oncology Database (OncoKB) del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center classifica le varianti geniche in quattro livelli in base al loro valore predittivo per l'uso dei farmaci: Livello 1/2, biomarcatori approvati dalla FDA o clinicamente standard che predicono la risposta di una specifica indicazione a un farmaco approvato; Livello 3, biomarcatori approvati o non approvati dalla FDA che predicono la risposta a nuovi farmaci mirati che hanno mostrato risultati promettenti negli studi clinici, e Livello 4, biomarcatori non approvati dalla FDA che predicono la risposta a nuovi farmaci mirati che hanno mostrato prove biologiche convincenti negli studi clinici. È stato aggiunto un quinto sottogruppo associato alla resistenza al trattamento.
Le linee guida dell'American Society for Molecular Pathology (AMP)/American Society of Clinical Oncology (ASCO)/College of American Pathologists (CAP) per l'interpretazione della variazione somatica suddividono la variazione somatica in quattro categorie: Grado I, con forte significato clinico; Grado II, con potenziale significato clinico; Grado III, significato clinico sconosciuto; Grado IV, di cui non si conosce la significatività clinica. Solo le varianti di grado I e II sono utili per le decisioni terapeutiche.
La scala di operabilità clinica del bersaglio molecolare (ESCAT) dell'ESMO classifica le varianti geniche in sei livelli: Livello I, bersagli adatti all'uso di routine; Fase II, un bersaglio ancora in fase di studio, che probabilmente verrà utilizzato per lo screening della popolazione di pazienti che potrebbe trarre beneficio dal farmaco bersaglio, ma sono necessari ulteriori dati a supporto di questa ipotesi. Grado III, varianti geniche bersaglio che hanno dimostrato un beneficio clinico in altre specie tumorali; Grado IV, solo varianti geniche bersaglio supportate da evidenze precliniche; Grado V, ci sono evidenze a supporto della significatività clinica del bersaglio della mutazione, ma la terapia con un singolo farmaco contro il bersaglio non prolunga la sopravvivenza, oppure è possibile adottare una strategia di trattamento combinato; Grado X, mancanza di valore clinico.